蛋白质组学筛选非酒精性脂肪肝的新型生物标志物与治疗靶点
Thrombospondin1improveshepaticsteatosisindiet-inducedinsulin-resistantmiceandisassociatedwithhepaticfatcontentinhumans
应用组学：蛋白质组学
期刊：EBioMedicine（IF=6.68）
导论
非酒精性脂肪性肝（NAFLD）的特点是肝脂肪变性，即肝脏中脂质积聚。肝脏脂肪变性与胰岛素抵抗、糖和脂代谢受损或心血管疾病有关。亚洲约有15-30%的成年人口患有NAFLD。NAFLD与分泌蛋白的产生有关，而分泌蛋白的特性及其在NAFLD发病中的作用尚不清楚。
6月21日，中科院上海营养与健康研究所李于课题组和医院高鑫课题组在顶级学术期刊《柳叶刀》旗下子刊EBioMedicine在线发表了题为“Thrombospondin1improveshepaticsteatosisindiet-inducedinsulin-resistantmiceandisassociatedwithhepaticfatcontentinhumans”的最新研究成果。该研究使用蛋白质组学技术，分析NAFLD患者血清中分泌蛋白的变化，发现了NAFLD患者血清中关键的生物标志物Thbs1，并发现了调节Thbs1活性可能对NAFLD具有潜在治疗价值。01NAFLD患者血清Thbs1水平在肝降脂干预后降低
为了确定NAFLD的候选调节因子，研究人员基于蛋白质组学技术分析NAFLD患者在肝降脂干预后血清的分泌蛋白的变化。在5例肝降脂干预后肝脂肪含量显著降低的患者进行血清蛋白质组分析，共鉴定出种蛋白质，11种蛋白在干预后发生了显著的变化，包括免疫球蛋白、复合物以及血栓反应蛋白1（Thbs1）等。之后，对另外35例接受肝降脂干预的患者的血清进一步验证了Thbs1的浓度的下调。此外，研究人员还发现Thbs1的降低率与肝脏脂肪含量的降低率正相关。因此，Thbs1的降低可能作为改善人类NAFLD的蛋白质组生物标记物。
02血清Thbs1水平与肝脂肪变性呈正相关
为了进一步证明Thbs1作为肝脂肪变性的生物标志物的作用，在另一组接受肝活检诊断的患者中测量了血清Thbs1水平。名受试者根据活检脂肪变性程度分为4组：0级（脂肪变性肝细胞5%）、1级（脂肪变性肝细胞5-33%）、2级（脂肪变性肝细胞34-66%）和3级（脂肪变性肝细胞66%）。血清Thbs1水平与脂肪变性程度的增加呈正相关，且与肝脂肪含量呈正相关。在脂肪变性程度较高的患者中，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和甘油三酯（TG）水平显著升高。结合肝降脂干预的患者的蛋白质组结果，证明了Thbs1作为NAFLD血清生物标志物的可信性。
03重组人Thbs1抑制HFHS诱导的小鼠肝脂基因表达及肝脂肪变性
鉴于Thbs1水平随肝脏脂肪含量的变化而变化，研究者们推测Thbs1可能起着调节肝脏脂质代谢的作用。为了验证这一假设，在高脂、高糖（HFHS）饮食的小鼠中皮下注射重组Thbs1，HE和油红染色显示肝脏脂肪变性减轻，且肝脏和血浆甘油三酯水平显著降低，表明肝脏脂质代谢改善，Thbs1治疗对脂质代谢有有益作用。接下来，研究人员探索了Thbs1减轻肝脏脂肪变性的机制，通过RTPCR检测参与脂肪从头合成中的关键酶的mRNA表达水平，发现给药Thbs1导致SREBP-1及其下游脂肪生成酶显著降低。总之，这些结果表明，给药Thbs1可能通过抑制SREBP-1的激活，降低小鼠肝脏新生脂肪的生成，改善HFHS饮食诱导的肝脂肪变性。
04Thbs1蛋白或多肽模拟物对高糖和胰岛素导致的肝细胞脂肪变性的抑制作用
为了研究Thbs1在体外是否具有改善肝脂肪变性的能力，用高糖加胰岛素处理Thbs1稳定高表达的HepG2细胞，以诱导细胞内脂质积聚。与上述体内实验结果一致，Thbs1的过表达抑制了高糖加胰岛素诱导的脂质聚集。此外，脂质油红染色结果和甘油三酯的定量结果均显示外源性Thbs1或其肽模拟物ABT-也可以抑制高糖加胰岛素诱导的原代肝细胞脂质积聚。这些观察表明Thbs1在体外能够抑制肝细胞中的脂质积累。
05Thbs1对肝细胞的降脂作用需要CD36
为了探讨Thbs1对新生脂质生成的抑制作用是否由CD36受体介导，从野生型和CD36基因敲除小鼠中提取原代肝细胞，然后用葡萄糖加胰岛素联合重组Thbs1蛋白或不加重组Thbs1蛋白治疗24小时。外源性Thbs1抑制用高糖加胰岛素治疗的WT原代肝细胞SREBP-1的剪切加工和FAS和SCD1蛋白质的表达水平，但不抑制CD36-KO的原代肝细胞。脂肪生成相关基因的mRNA水平，如FAS、SCD1、ACC1和ACLY，在经Thbs1处理的WT而非CD36KO原代肝细胞中下调。此外，Thbs1处理WT肝细胞后甘油三酯积累减少，而处理CD36KO肝细胞后甘油三酯积累不变，这提示CD36可能介导Thbs1抑制脂肪生成。ABT-也可抑制高糖加胰岛素治疗的WT原代肝细胞SREBP-1的剪切加工和FAS、SCD1蛋白水平，并呈现剂量依赖性。ABT-处理WT肝细胞后甘油三酯积累显著减少，而处理CD36KO肝细胞甘油三酯积累轻微减少。这些结果表明Thbs1或其肽类似物在肝脏新生脂肪形成中的作用可能是由CD36介导的。
结论
本研究表明，细胞外蛋白Thbs1可作为人类肝脂肪变性的生物标志物，给药Thbs1足以减轻HFHS饮食诱导的肥胖小鼠肝脂肪变性。Thbs1-CD36轴介导的脂肪生成抑制可能是Thbs1的药物和基因激活减弱肝脂肪变性的机制。这些发现支持了Thbs1及其肽模拟物在治疗NAFLD及相关代谢疾病方面的潜在临床应用。
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